法事科仪:基于一测多评法的当归药材质量控制研究

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当归Angelicae SinensisRadix ，又名文无，是伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels.的干燥根法事科仪。味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效[1]。目前，对于当归化学成分及药理作用的研究已经较为全面。当归中的化学成分主要包括苯酞类、香豆素类、黄酮类、有机酸类及其他成分[23]。它的药理作用广泛，既能作用于心血管系统和血液系统，还有抗炎、抗氧化和增强免疫的功效[49]。

阿魏酸是当归中的主要活性成分，以游离型或结合型存在于药材中法事科仪。阿魏酸与松柏醇结合形成的阿魏酸松柏酯是最主要的结合形式之一[10]。阿魏酸松柏酯有很高的生物活性，它不仅是当归挥发油中抗氧化活性的来源[11]，还是谷胱甘肽S转移酶的强抑制剂，对潜在肿瘤多药耐药有逆转作用[12]。但它不稳定，极易在光和高温的条件下分解为阿魏酸[10]。目前，《中国药典》2020年版中对当归的要求为阿魏酸含量不得少于0.05%。有文献建议，由于结合型阿魏酸与游离型阿魏酸之间的转化关系，应当将总阿魏酸含量作为当归的质量评价指标[13]。除此以外，药典中并未对当归中的另一主要活性成分藁本内酯的含量加以控制。基于本课题组对当归的前期研究[1415]，以及当归中苯酞类成分之间的相互转化作用[1617]，本课题组建立了一测多评法（quantitative analysis of multicomponents by a single marker，QAMS）同时测定[1819]当归中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞的含量测定方法，为中药当归质控标准的制定提供一种方法和手段。

1 材料

BSA124S型、CPA225D型电子分析天平，德国Sartorius公司；SB5200T型超声仪，宁波新芝生物公司；2998PDA型Waters液相色谱仪（检测器），美国Waters公司法事科仪。色谱纯甲醇、乙腈、甲酸和磷酸为Fisher公司生产。

实验所收集的当归样品均经北京中医药大学中药学院鉴定系王晶娟副教授鉴定为伞形科植物当归A. sinensis (Oliv.) Diels.的干燥根法事科仪。样品信息见表1。阿魏酸（批号H25M6L1）对照品购于源叶生物，洋川芎内酯I（批号180428）、洋川芎内酯H（批号180121）、丁烯基苯酞（批号171004）、藁本内酯（批号170804）对照品购于北京四面体生物科技发展有限公司，质量分数大于98%。对照品阿魏酸松柏酯（171216）购于北京四面体生物科技发展有限公司，质量分数大于95%。

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2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Waters XSelect CSH（250 mm×4.6 mm，5 μm）法事科仪。进样量10 μL，检测波长265 nm，体积流量1.0 mL/min，柱温40 ℃，流动相为0.085%磷酸水（A）乙腈（B），梯度洗脱：0～20 min，15%～26%B；20～23 min，26%～46%B；23～45 min，46%B；45～50 min，46%～90%B；50～55 min，90%B。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞对照品适量，分别置棕色量瓶中，加甲醇稀释定容置刻度线，得到的溶液质量浓度依次为3.2、4.1、0.7、13.9、80.4和8.4 μg/mL法事科仪。由于本实验使用的对照品多数性质不稳定，制备后应立即使用，临时保存可置于−20 ℃冷冻，但再次使用前需重新标定含量。

2.3供试品溶液的制备

取当归粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入95∶5甲醇甲酸20 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用95∶5甲醇甲酸补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液法事科仪。

2.4 色谱条件的优化

为保证被定量化合物良好的分离度和适当的保留时间，本实验对流动相梯度程序、柱温和检测波长进行了考察法事科仪。本实验用PDA检测器的高效液相色谱仪对样品进行全波长扫描，在265 nm处各主要吸收峰强度较大，且各峰与在260 nm和270 nm处的吸收度差别较小，故选择了265 nm为扫描波长，图1为255、265、275、285和300 nm下的色谱图；为提高藁本内酯和相邻色谱峰丁烯基苯酞的分离度，本实验尝试了多个流动相梯度，最后确定为上述的梯度程序。应用以上所建立的色谱条件进行分析，所得到的对照品和样品的色谱图见图2，图中，6个被测化合物都实现了良好的分离。色谱图中的6个待测化合物的鉴别是通过对比保留时间以及加入对照品的方法完成的。

2.5 方法学考察

2.5.1线性关系考察、检测限和定量限测定精密吸取对照品贮备液分别稀释至6个不一样浓度，按“2.1”项下色谱条件分别测定阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞的峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算标准曲线，结果见表2法事科仪。当信噪比（S/ N ）为3时的被测物浓度为检测限，S/ N 为10时的被测浓度为定量限，据此测得6个成分的检测限和定量限见表2。

2.5.2精密度试验精密吸取同一供试品溶液10 μL，按“2.1”项下方法连续进样6次，记录峰面积，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞保留时间的RSD分别为1.14%、0.99%、0.97%、0.52%、0.80%和0.82%，峰面积的RSD分别为1.98%、1.77%、2.00%、1.03%、0.68%和0.79%，表明仪器精密度良好法事科仪。

2.5.3稳定性试验取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯和丁烯基苯酞峰面积的RSD分别为0.95%、0.40%、0.44%、0.32%、0.29%和1.11%，表明供试品溶液在24 h内测定结果稳定法事科仪。

2.5.4重复性试验重复称取同一供试品6份，约0.2 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备样品，测定，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞RSD均小于2%法事科仪。表明该方法的重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验重复称取当归药材粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，分别精密加入含阿魏酸（0.104 μg）、洋川芎内酯I（0.122 μg）、洋川芎内酯H（0.024 μg）、阿魏酸松柏酯（0.431 μg）、藁本内酯（2.413 μg）和丁烯基苯酞（0.211 μg）的对照品溶液，照“2.1”项下方法制备，测定并计算加样回收率，阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯和丁烯基苯酞的平均加样回收率分别为98.45%、97.04%、97.57%、100.24%、102.25%和101.34%，RSD分别为2.37%、2.89%、2.47%、1.46%、1.93%和2.02%法事科仪。

2.6 相对校正因子（fs/ i ）的计算

精密吸取混合对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件测定，进样4次，记录各化合物的色谱峰面积，根据fs/ i 计算公式[18]，以藁本内酯为内标，计算阿魏酸对藁本内酯的校正因子f1，洋川芎内酯I对藁本内酯的校正因子f2，洋川芎内酯H对藁本内酯的校正因子f3，阿魏酸松柏酯对藁本内酯的校正因子f4和丁烯基苯酞对藁本内酯的校正因子f5的平均值，分别为1.078 7、0.565 3、0.466 9、0.950 1、1.156 9法事科仪。

fs/ i ＝fs/ f i ＝( A s / C s )/( A i / C i )

As为藁本内酯内标物的峰面积法事科仪，Cs为藁本内酯内标物的浓度，A i 为被测指标组分i的峰面积，C i 为被测指标组分i的浓度

2.7 f的重复性考察

2.7.1 不一样仪器及色谱柱对RCF的影响取“2.2”项下的混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，分别采用Waters XSelect CSH1、Waters XSelect CSH2、Waters XSelect CSH3色谱柱，在WATERS2998 PDA和岛津SPD20A高效液相色谱仪上进样检测，求算以藁本内酯作为参照成分时，5种成分的fs/ i ，结果讲明fs/ i 在使用不一样仪器时的耐用性良好，结果见表3法事科仪。

2.7.2 测定不一样体积流量对f值的影响用同一台液相色谱仪，分别在0.95、1.00、1.05 mL/min的体积流量下测定阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞的峰面积，计算f的平均值分别为1.125 0、0.578 1、0.474 5、0.960 3、1.153 9，RSD分别为0.82%、1.63%、7.75%、2.50%和1.27%法事科仪。结果表明在同一台高效液相色谱仪上，体积流量变化f的影响不大。

2.7.3测定不一样柱温对f值的影响用同一台液相色谱仪，分别在柱温为35、40、45 ℃的条件下测定阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞的峰面积，计算f的平均值分别为1.120 3、0.569 4、0.473 3、0.947 5、1.139 9，RSD分别为2.88%、1.60%、1.46%、0.70%和1.76%法事科仪。结果表明在同一台高效液相色谱仪上，柱温的变化对f值的影响不大。

2.8 样品的含量测定

采用常规对照品外标法和QAMS法分别测定了31批当归中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞的含量，见表4法事科仪。结果显示2种方法所测得的含量无明显差异。

3 讨论

由于当归中主要包括有机酸类、苯酞类以及香豆素类成分，为了能较全面地评价药材质量，本实验除了对色谱条件进行优化，还对当归样品提取条件进行优化，主要包括提取方式、提取溶剂和提取时间3个方面法事科仪。本实验首先考察了回流提取和超声提取的差异，发现由于阿魏酸松柏酯是阿魏酸的结合形式存在于药材中，且易受热分解为阿魏酸，因此其对提取方式的选择最敏感。由于超声提取效率较高，及其操作的便捷性，本实验选择超声提取作为当归的提取方法。在超声提取时间的选择上，本实验共筛选了超声15、30、45、60 min 4个梯度。结果表明超声15 min对总阿魏酸的提取效果最好，超声30 min对苯酞类成分的提取效果最好，综合考虑选择超声提取时间为30 min。

在提取溶剂方面，本实验考察了不一样体积分数的甲醇溶液：70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、纯甲醇和95%甲醇5%甲酸溶液[13]法事科仪。70%、80%甲醇对阿魏酸提取率最高，而阿魏酸松柏酯在95%甲醇 5%甲酸溶液中最稳定，提取率最高。从总阿魏酸、藁本内酯及丁烯基苯酞含量来看，最终选择了95%甲醇5%甲酸溶液作为当归的提取溶剂。最终确定的提取方法为95%甲醇5%甲酸溶液超声提取30 min。

本实验建立的高效液相色谱法实现了同时对当归中6个成分的含量测定，为提高当归质量控制标准提供了科学、简便的方法法事科仪。在药典规定成分的基础上，从阿魏酸改为总阿魏酸，并增加了苯酞类成分作为指标，可以更加全面地控制当归药材质量，为当归质量标准提升提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：李小阳法事科仪，翟小林，王 丹，范 晶，裴纹萱，董 玲，孙 裕，宋学斌，王晶娟．基于一测多评法的当归药材质量控制研究 [J]. 中草药, 2022, 53(20): 63546360 .

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