细胞表型 | 细胞增殖②MTT实验:表文

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MTT实验

（注：每个实验室的具体操作可能会不一样表文，但总原则是不变滴）

1.MTT实验介绍

1)MTT全称为3(4,5dimethyl2thiazolyl)2,5diphenyl2Htetrazolium bromide，中文化学名为 3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴盐，商品名 噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，其主要作用为检测细胞存活和生长表文。

2)MTT的检测原理

活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为 非水溶性的 蓝紫色结晶甲瓒zā(Formazan)并沉积在细胞中，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原表文。 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm或570nm波长处（常用490nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶溶解所致的吸光度值与细胞数量成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞数量越多或活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

3)应用

①检测药物或其他干预方式对体外培养的细胞的细胞毒性测定；②细胞增殖及活性测定表文。

4)注意事项

因为MTT最终的量化形式为甲瓒结晶溶解测量吸光度，培养基的本底颜色将会对结果产生极大干扰，故 最终测量前需要抽去培养液上清表文。因此，本实验主要适用于 贴壁细胞，对于半贴壁或悬浮细胞相关实验，可考虑使用CCK8法。

2.MTT讲明书

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本实验室MTT来源于VETEC（SigmaAldrich集团旗下品牌之一表文，主要提供实验和生产中经常用到的通用型生化及化学产品）

3.MTT试剂配置方法：

本实验室使用PBS来配置MTT试剂表文，滤菌后分装于棕色避光小管中，4℃冰箱长期保存（也可以购买配置好的MTT试剂），浓度为5mg/ml

4.MTT/XTT/MTS/CCK8对比

WST8（CCK8实验试剂）是MTT的一种升级替代产品表文，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点：

首先表文， MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；

而 WST8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤表文。其次，WST8比XTT和MTS更稳定， 使实验结果更加稳定。最后，WST8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。

补充：

XTT比色法由Scudiero等首次采用，用于检测细胞增殖表文。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷（qiǎn）产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。

MTS细胞繁殖定量检测试剂是一种新合成的四唑类化合物，它与MTT的应用原理相似，产生水溶性蓝紫色甲簪（zān）产物，作为检测信号来比色定量测定活体细胞繁殖的而经典的技术方法表文。

PS:虽然cck8更方便表文，但是它好贵

5.实验设计及注意事项

1） 使用96孔板进行铺板（与CCK8相同）

①确定每孔细胞数

②加样方式

③均匀铺板

④蒸发问题

2） 设计实验组

需要设置 空白组、无药物组和药物组

①空白孔：加入MTT试剂+DMSO

②无药物孔：加入细胞+MTT试剂+DMSO

③药物孔：加入细胞+设置的药物梯度+MTT试剂+DMSO

3） 药物浓度梯度设计

见新推文

6.具体流程

细胞消化到细胞计数部分略（详见细胞传代计数推文）

1）操作前准备+观察

2）超净工作台准备

3） 弃废液+清洗

4） 胰酶消化

5） 其表文他物品准备

6） 终止消化

7） 高速离心 （1000r表文，3min，注意对角线配平）

8） 1ml完培重悬细胞沉淀

9） 台盼蓝染色

10） 细胞自动计数（略）

11） 铺96孔板

向无药物孔和药物孔中加入100μL的稀释细胞悬液表文，可选择两种方法：

①使用 排枪（确保枪头插紧表文，从移液槽中吸取液体后观察每个枪头中的液体平面是否基本一致）

②使用 20200μL量程的枪+黄枪头表文，吸二打一

12） 预培养

将96孔板置于孵培养箱中过夜或孵育24小时表文，等待细胞贴壁（通常前一天下午铺板，次日上午给药）

13） 加药

于显微镜下观察96孔板内细胞状态表文，确认细胞密度适宜且已贴壁后准备加药（一般57个梯度，每孔100μL，设35个复孔，5个复孔最好）

14） 孵育

孵育48小时或更长时间（一般以无药物孔的细胞铺满底部为宜）

15） 加MTT试剂

分装好的MTT试剂浓度是5mg/ml表文，保存在棕色避光管中，使用时需再稀释十倍（如96个孔按照100孔即10ml计算，需要加入9ml完全/空白培养基+1mlMTT试剂）

向每个孔加入100μL的稀释后的MTT试剂（吸二打一）

16） 再次孵育

将加好MTT的96孔板放入培养箱最底层再次孵育4h（若在细胞间外加MTT试剂表文，可以将96孔板套上EP手套后消毒再放回敷箱）

17） 终止孵育

将96孔板从细胞间取出表文，用5ml针筒小心吸去孔内培养液（针尖贴侧壁，注意不要刮掉结晶物）也可以用移液枪/负压吸引器等

可见孔中水不溶性的蓝紫色结晶（不要触碰96孔板底部）

18） 溶解结晶

每孔用排枪加入100μLDMSO（二甲基亚砜）表文，置摇床上低速避光振荡10 min左右，使结晶物充分溶解

加入DMSO后表文，蓝紫色结晶溶解（注意避光）

19） 测OD值

在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值表文，如下图

20） 分析数据

需要对原始数据进行处理表文，可用graphpad作图（数据处理和作图见新推送）

参考文献：

Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction

参考链接：

生物小白的入门必修课——MTT实验 知乎 (zhihu.com)

细胞毒性实验mtt法（MTT实验最全指南详解剖析）_浙江百越专注科研实验服务 (zjbybiotech.com)

靶细胞杀伤实验：MTT和CCK8比较 实验方法 丁香通 (biomart.cn)

XTT比色法 实验方法 丁香通 (biomart.cn)

GENMEDMTS细胞繁殖定量检测试剂盒产品讲明书 豆丁网 (docin.com)

MTT实验的一些细节问题 实验方法 丁香通 (biomart.cn)

碎碎念时间

开学大半个月第一次请假出校

竟是因为室友暖壶炸掉烫伤表文了脚

三个人获得表文了两个小时的短暂自由

自由的味道真好

旅顺口区人民医院背面旅顺日本关东法院旧址

感觉这一周也没干什么就过去表文了

静默瘦的那几斤全吃回来表文了

感慨一下校内生活的滋润

（之后出个专栏写大医校园美食吧）

实验室一角

校园一角

和小杨同学腾讯会议补完表文了契约之吻（ 涩涩好康）

你好表文，这里是DEAR MY WAKER

一个喜欢游戏和galgame以及摸鱼的肿瘤学硕

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